فرمت ورد قابل ویرایش

تعداد صفحات: 26

فصل دوم مبانی نظری و پیشنه تحقیق جهت نوشتن فصل دوم پایان نامه ارشد و دکتری

همراه با رفرنس نویسی و پاورقی داخل متن

منابع فارسی کامل

منابع انگلیسی کامل

مروری برتحقیقات گذشته:

تحقیقات در مورد سلولهای بنیادی درحدود سال 1970 شروع شد(14). گزارشات متعددی در زمینه تمایز نورونها از سلولهای بنیادی موش و انسان وجود دارد. بر اساس مطالعات  Bainو همکارانش در سال 1995 تأثیر رتینوئیک اسید و تأثیر نواحی دارای مورفولوژی روزت بر روی سلولهای بنیادی جنینی و در پی آن تمایز این سلولها به سلولهای عصبی را نشان دادند. همچنین  Zhangدر سال 2001 نواحی دارای مورفولوژی روزت را نواحی القا کننده نورواکتودرم اولیه معرفی نمود(6). Okab و همکاران FGF را به عنوان عامل میتوژن در تکثیر سلولهای بنیادی تمایز یافته معرفی کرده اند و محققین دیگر نیز چونRao  و Li وMojtaba   با تغییراتی که در روش ساده Bain دادند توانستند در شرایط in vitro  تعداد بیشتری ازسلولهای تمایز یافته عصبی را بدست آورند(12و55).  Rolletshekو همکارانش با روش قطرات معلق، کلنیهای سه بعدی اجسام شبه جنینی^[1] 200 سلولی را بدست آوردند و آنها را به شکل سوسپانسیون در محیط بدون سرم کشت دادند و بعد از انتقال بر پلیت پوشیده با پلی لیزین و لامینین در حضورbFGF²و EGF³سلولهای اجدادی عصبی را تکثیر ونورونهای دوپامینرژیک را تشکیل دادند(59).

سلولهای بنیادی واقع در مغز استخوان برای اولین بار توسط Friedenstein و Petrakova در سال 1966 شناسایی شدند. این محققین در مطالعه ای سلولهای پیش ساز استخوان را از مغز استخوان موش صحرایی استخراج و توصیف کردند. ولی شواهد قطعی توسط Friedenstein در سال 1970 ارائه شد(4). این محقق نمونه های مغز استخوان را در یک ظرف پلاستیکی کشت داد و پس از 4 ساعت یا بیشتر سلولهای غیر چسبنده را دور ریخت. در اصل این سلولهای دور ریخته شده سلولهای رده خونساز بودند. او گزارش کرد که بخش کوچکی از سلولهای مغز استخوان از لحاظ ظاهر هتروژن بوده در واقع همان بخش که اتصالات محکمی با سطح دیش کشت بر قرار می کنند چسبنده هستند. این تجمعات به مدت 2 تا 4 روز خاموش ماندند و پس از آن به سرعت تکثیر یافتند. این سلولها پس از چندین بار پاساژ به صورت یکدست دوکی شکل ظاهر شدند(4). مشاهدت ابتدایی Friedenstein، توسط چندین محقق به ویژه piersma و owen و همکاران در سال 1980 توسعه پیدا کرد(57).

 مطالعات قبلی نشان داده اند که سلولهای مزانشیمی مغز استخوان توانایی تمایز به سلولهای عصبی را دارا می باشند (41). مطالعات مختلفی در زمینه تمایز این سلولها به سلولهای نورونی صورت گرفته است.

اولین تلاشها در زمینه تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای نورونی توسط  woodbury آغاز شد وی این کار را با استفاده از مرکاپتواتانول و DMSO^[2]روی سلولهای بنیادی مزانشیمی انسانی انجام داد و مشاهده کرد که اگرچه تغییرات مورفولوژیکی محسوس در این سلولها اتفاق می افتد ولی این القا روش کارآمدی نمی باشد زیرا سلولهای حاصل از نظر عملکردی غیر فعال بودند. به هر حال این گزارش اولین نوید در زمینه کاربردی کردن این نوع از سلولهای بنیادی در درمان ضایعات نخاعی داده شد. در ادامه Guillermo  با استفاده از فاکتورهای رشد forskolin وbFGF و تهیه بستر مناسبی از پروتئین L-لیزین و کونکاناوالینA وترکیبی از القا کننده های شیمیایی توانست سلولهای بنیادی مزانشیمی موش صحرایی را تا حدود 60% به سلولهای عصبی تمایزدهد. وی مکانیسم مولکولی این تمایز را خاموش شدن بیان ژنهای مزانشیمی در مقابل شروع بیان ژنهای نورونی عنوان کرد. همچنین  Andreasو herman نیز توانست با استفاده از محیط فاقد سرم و فاکتورهای رشدbFGF وEGF کشت این سلولها بصورت سوسپانسیون سلولهای مجتمعی مشابه ساختارهای نوروسفیری را از سلولهای مزانشیمی بدست آوردند. آنها متوجه شدند کهMSCها بطور عادی 3تا4% پروتئین نستین را در خود بیان می کنند و بعد از القایی که با استفاده از فاکتورهای رشد بر روی این سلولهای پیش ساز بدست آمد هیچ کدام از پروتئینهای اختصاصی سلولهای بالغ نورونی را بیان نمی کردند(21، 31، 45،67،70). نتایج تحقیقات sanchez و woodbury در سال2000، تمایز سلولهای مزانشیمی به سلولهای عصبی را در محیط آزمایشگاه با روش مولکولی وسترن بلات مورد تأیید قرار داد(43). براساس گزارش دیگری jiang  و همکارانش درسال 2002 جمعیتی از سلولهای بنیادی را از مغز استخوان موشها جدا کرده و به موشهای بالغ تزریق کردند. این سلولها به سلولهای خونی وسلولهای عصبی تمایز یافتند(48). همچنین مطالعات سنچز راموس و همکارانش نشان دادند که سلولهای استرومایی مغز استخوان دارای ظرفیت تمایز به سلولهای عصبی بوده وی از اسید رتینوئیک²،BDNF ³، فاکتور رشد عصبی، ترانسفرین و سلنیوم استفاده کرد و به دنبال آن بخشی از سلولها مارکر عصبی Neun (حدود 5 درصد) و بخش دیگر مارکر آستروسیتی GFAP (حدود یک درصد) را بیان کردند(61،71، 60). 

سیتوکینها، فاکتورهای رشد، نوروتروفینها، در محیط کشت باعث تمایز سلولهای استرومایی مغز استخوان به سلولهای عصبی در محیط کشت می شوند، BHA ^[3]، ² BHT،  DMSO، 5-azacytidin، در محیط کشت یا هر عاملی که بتواند سطحCAMP داخل سلولی را افزایش دهد می تواند این سلولها را به سمت سلولهای عصبی سوق می دهد(71، 74، 28) و همچنین دنگو و همکارانش نیز در تحقیقات خود به این نتیجه رسیدند که عوامل افزایش دهنده CAMP درون سلولی نظیر Isobutyl Methyl Xanthin  وDibutyry CAMP نیز موجب تمایز سلولهای BMSC به سلولهای عصبی می گردند(33).

نتایج تحقیقات نعمتی و همکارانش نیز در 2009 نشان داد که این سلولها با کمک القا کننده  EGFو bFGFو رتینوئیک اسید توانایی تمایز به سلولهای عصبی را دارا می باشند، وی توانست تا حدود 90 درصد مارکر نستین و تا حدود 41 درصد مارکر b توبولین و حدود 67 درصد بیان مارکر  GFAPافزایش دهد(21). در طی تحقیقات رضایی و همکارانش در سال 2011 در رابطه با بررسی اثر ₄BMP³ در القا سلولهای عصبی از سلولهای بنیادی مزانشیمی به این نتیجه رسید که ₄BMP به عنوان یک عامل بازدارنده تمایز سلولهای بنیادی مزانشیمی به سلولهای عصبی می باشد(52).

در ادامه در بررسی اثر لیتیوم کلراید در القای سلولهای استرومایی مغز استخوان به سلولهایی با فنوتیپ عصبی که توسط علیزاده و همکارانش صورت گرفت به این نتیجه رسیدند که لیتیوم کلراید در دوز mM 0.5 به عنوان دوز بهینه قادر است سلولهای استرومایی مغز استخوان را به سلولهای عصبی تمایز دهد همچنین در این تحقیقات اثبات شده است که این دارو در invivo و invitro اثرات محافظتی بربافت عصبی داشته و تکثیر سلولهای پیش ساز عصبی را افزایش می دهد(18). در تحقیقاتی کاشانی وهمکارانش تأثیرداروی سلژیلین بر میزان بقا و القای فنوتیپ عصبی در سلولهای استرومایی مغز استخوان مورد بررسی قرار گرفت و شمارش سلولی و بررسی آماری نشان داد که غلظتهای ^6-10 و ^7-10 و ^8-10 سلژیلین، بیشترین تأثیر را بر میزان بقای سلولهای استرومایی دارند. غلظت^8-10 مولار سلژیلین تأثیر بسزایی بر تمایز این سلولها به سمت سلولهای عصبی دارد و غلظت مذکور باعث القای بیان ژنهای نوروتروفیک NGF و BDNF  و GDNF و NT4/5 در سلولهای تمایز یافته شد(10).

1-2- کلیات:

بسیاری از بافتهای بالغ از سلولهایی تشکیل شده اند که نمی توانند جایگزین شوند بعنوان مثال اغلب نورونها و استخوانها در صورتی که آسیب ببیند و یا از بین بروند جایگزین نخواهند شد. با این وجود جمعیتی از سلولهای متعدد نیز وجود دارند که سلولهای آنها بطور دائم می میرند و جایگزین می گردند که ممکن است جمعیتی از سلولهای بنیادی^[4] این سلولهای از دست رفته را جایگزین نمایند(38).

از دیدگاه دانشمندان سلول بنیادی به یک سلول تمایز نیافته با توانایی تکثیر، خود نوزایی² و تولید دودمانهای سلولی متفاوت اطلاق می گردد(13،1). پیشرفتهای اخیر در رابطه با سلولهای بنیادی بر پایه پتانسیل این سلولها به عنوان یک منبع بافت برای درمان و ترمیم بافت دلالت دارند(43).

1-2-1- سلولهای بنیادی از نظر منشأ:

بطور کلی سلولهای بنیادی دارای 3 منشأ اصلی می باشند که عبارتند از:

1-2-1-1- سلولهای بنیادی بند ناف ومادری³:

بند ناف یکی ازمنابعی است که سلولهای بنیادی همه توان⁴ را دارا می باشد(38). این سلولها به علت دسترسی آسان، بدست آوردن بدون مشکل و خطر کم آلودگی ویروسی امروزه بعنوان یک منبع مهم برای بدست آوردن سلولهای بنیادی مطرح هستند(11).

کشت سلولهای خون بند ناف در محیط های کشت مختلف موجب تمایز این سلولها به غضروف، سلولهای کبدی، سلولهای استخوان، آستروسیت یا نورونها می شود. پزشکان توصیه می کنند که سلولهای بند ناف نوزادان را منجمد کرده تا در آینده برای پیوند در دسترس باشند. دیده شده که وقتی سلولهای بندناف                            به موشهای صحرایی که بافت قلبی آنها آسیب وارد شده بود پیوند زده شد به سلولهای قلبی تمایز یافتند. (38).

1-2-1-2- سلولهای بنیادی جنینی^[5]:

سلولهای بنیادی جنینی از توده سلولی بلاستوسیتهای² پستانداران مشتق می شوند(43،6،48) و برخی معتقدند که از نظر عملکرد معادل بلاستومرهای توده سلولی داخلی هستند. یکی از بهترین شواهد آن است که وقتی سلولهای بنیادی جنینی به ICMهای بلاستوسیت های موش تزریق شده اند شبیه بلاستوسیت های موش رفتار کرده و در ساختار جنینی شرکت می کنند(43).

سلولهای بنیادی جنینی انسان را با استفاده از دو روش اصلی به دست می آورند. در روش اول این سلولها از بلاستومرهای توده سلولی داخلی بلاستوسیت های حاصل از لقاح آزمایشگاهی مشتق می شوند، در روش دوم این سلولها از سلولهای زایای مشتق شده از جنین هایی که به طور خود به خود سقط شده فراهم می شوند(38).

اخیراً جدا سازی و کشت سلولهای بنیادی جنینی فرصت های جدیدی را برای پزشکی به نمایش گذاشته است، اگر چه مشکلات مهمی باقی می ماند اول اینکه اشتقاق سلولهای بنیادی از بلاستوسیت های بارور در آزمایشگاه مسائل اخلاقی ایجاد می کنند و دوم اینکه تکنیک های اخیر برای تمایز به جمعیتهای سلول سوماتیک فرآورده های نا خالص را با پتانسیل تومور زا به بار می آورد(43). سلولهای بنیادی جنینی را می توان در درمان بیماریها و همچنین به عنوان دارو و توکسین مورد استفاده داد(6).

سلولهای بنیادی جنینی و سلولهای کارسینومای جنینی همانند توده سلولی داخلی بلاستوسیتهای موش تعدادی از نشانگرهای سطحی سلولهای پر توان جنینی را نشان می دهند. این نشانگرها برای تفکیک سلولهای EC³و ES⁴ موشی از سلولهای ES و EC انسانی نیز قابل استفاده هستند. مثلاً سلولهای EC و ES موشی SSEA-1 ⁵را بیان میکنند در حالیکه سلولهای ES و EC انسانی آن را بیان نمی کنند و در عوضSSEA- 3 و 4 SSEA- را بیان می کنند، سلولهای زاینده بدوی EG⁶ انسانی که از سلولهای زاینده بدوی(PGCS)

مشتق می شوند هر سه نشانگر SSEA-1 و SSEA-3 و4 SSEA- را بیان می کنند. اهمیت زیست شناختی الگوی بیان این آنتی ژنهای سطحی مشخص نیست اما ممکن است که بیان SSEA-1 درارتباط با صنعت رشد سلولها در محیط آزمایشگاهی باشد. سلولهای نامتمایز ES و EC انسانی تمایل به رشد بصورت کلنیهای مسطح را دارند و در ضمن کلنیهای آنها نسبتاً نا متراکم است. در مقابل کلنیهای ES و EC موشی متراکم چند لایه هستند(7). سایر نشانگرهای سلولهای بنیادی جنینی آنتی ژنهای سطح T_RA1-60وT_RA1-81 و آنزیم آلکالین فسفاتاز است که تمام آنها را در سلولهای بنیادی جنینی انسان و موشی که کاریوتیپ غیر طبیعی دارند شاخص مزبور را بیان می کنند(26،27،7).

بطور کلی سلولهای بنیادی جنینی دارای خصوصیات زیر می باشند:

1.    از  ICMبلاستوسیتها جدا می شوند.

2.    توانایی تکثیر بالایی دارند.

3.    سطح بالایی از oct4 را بیان می کنند، این فاکتور سبب مهار و تکثیر دسته ای از ژنها می شود که سلولهای بنیادی جنینی را در حال تکثیر و غیر تمایزی نگه می دارد.

4.    فعالیت تلومراز را نشان می دهند.

5.    توانایی تشکیل انواع سلولهای آندودرمی و مزودرمی و اکتودرمی را دارا می باشند.

6.    طی تکوین، دارای توان ادغام در بافتهای جنینی می باشند (سلولهای بنیادی جنینی موش به مدت طولانی در محیط آزمایشگاهی حفظ شده اند و پس از اینکه به داخل یک جنین در مرحله بلاستولای یک جانور دیگر وارد می شوند، می توانند هر بافتی را به وجود آورند که حاصل آن ایجاد جانور کایمرا است).

7.    دارای توان کلون زایی می باشند به این معنی که یک سلول منفرد دارای توان تولید یک کلونی متشکل از سلولهای با خواص ژنتیکی یکسان می باشند و یا اینکه کلونها دارای خواص مشابه سلول مبدأ می باشند.

8.    فاقد نقطه کنترل ₁G می باشند، سلولهای بنیادی جنینی بیشتر زمانشان را در فاز  Sمی باشند، برخلاف سلول سوماتیکی تمایز یافته، سلولهای بنیادی جنینی نیازی به تحریک بیرونی آغاز همانندسازی DNA ندارند.

 9. سلولهای بنیادی جنینی، غیر فعال شدن کروموزومهای  xرا نشان نمی دهند. در هرسلول سوماتیک پستانداران ماده، یکی از دو کروموزوم x، بطور دائم غیر فعال نمی شود غیر فعال شدن کروموزوم x در سلولهای بنیادی جنینی روی نمی دهد(46،43،6،7).

توانایی تمایز سلولهای بنیادی جنینی به انواع سلولها از جمله سلولهای عصبی به اثبات رسیده است. سلولهای اجدادی عصبی که از سلولهای بنیادی ناشی می شوند ممکن است که هدایت شوند تا به نورونهای، بالغ، آستروسیت ها و الیگو دندروسیتها تبدیل شوند(43).

در شرایط طبیعی توده سلولی داخلی در طی مراحل گاسترولاسیون سه لایه جنینی اکتودرم، مزودرم، آندودرم را ایجاد می کند سپس با القاء مزودرم بر اکتودرم موجب تشکیل سیستم عصبی می شود با در نظر داشتن توان بالقوه سلولهای بنیادی جنینی در تشکیل انواع سلولها می توان با القا مسیر های نورون زایی تمایز آنها را به سمت تشکیل نورون سوق داد. سلوهای بنیادی جنینی دارای توانایی تولید نورون ها و سلولهای گلیا می باشند و حتی در مواردی گروههای خاصی از نورنها مانند دوپامینرژیک مغز میانی را ایجاد می کنند(6).

سلولهای بنیادی جنینی در پزشکی اهمیت زیادی دارند و نقطه امید در اینجاست که از سلولهای بنیادی جنینی در تولید نورونهای جدید برای بیماران مبتلا به بیماریهای تحلیل رونده مغزی مثل بیماری آلزایمر و پارکینسون یا آسیب های نخاعی، تولید پانکراس جدید برای افراد مبتلا به دیابت یا تولید سلولهای خونی تازه برای افراد به مبتلا به کم خونی استفاده کرد. با وجود این سلولها این امکان وجود دارد که سلولهای قلبی جدیدی جایگزین بافت آسیب دیده افرادی شود که مشکل قلبی دارند و کسانی که از نقص ایمنی رنج می برند بتوانند سیستم ایمنی خود را بازسازی کنند(38).

از میان سلولهای بنیادی، سلولهای بنیادی جنینی به دلیل ویژگی خاص همچون تقسیم نامحدود و بدون تمایز و حفظ کاریوتیپ طبیعی کروموزومی بیشتر مورد توجه قرار می گیرد(6)، اما دستیابی به سلولهای بنیادی جنینی پر هزینه و دشوار بوده و با مشکلات اخلاقی فراوان روبرو است. بنابراین تحقیق برای منبع جایگزین این سلولهای بنیادی ارزش زیادی دارد(11 ).